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              分析方法驗證系列:第九節--生物學檢測方法參數驗證及案例

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              樓主 2020-06-09 06:51:22
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              關注公眾號每天獲得馬教授原創文章 

              1
              專屬性

              生物學測定方法的專屬性與測定方法及產品組成密切相關,所以應從測試原理、測試用材料和供試品組成等方面分析方法的專屬性。

              如採用免疫印跡試驗進行生物製品的鑒別,應首先對所使用抗體的特異性進行分析;若供試品中還存在其它組分,則應進一步驗證被檢測物中其它物質能否引起非特異性免疫反應。

              如採用細胞測定方法檢測生物活性,應首先說明被測物質與特定的細胞應答之間的相關性。為表明細胞測定方法的特異性,可進行相關試驗進行驗證,如加入抗體或特異抑製劑的封閉實驗等。如果成品中加入了可能影響活性測定的輔料,應進行相關驗證以排除此種影響。

              如採用 ELISA 法檢測重組產品的殘餘宿主蛋白含量,可採用與表達體系相同的宿主細胞的蛋白作為免疫原製備抗體,若採用與產品相似工藝進行處理后再免疫動物,則所獲得抗體的特異性更好。另外,產品中存在的大量目的蛋白可能影響殘餘宿主蛋白的測定,應進行相關驗證以排除此種影響。

              2
              準確度

              生物製品的生物學活性為相對活性,一般與同時進行測定的標準品/參考品進行比較而得,所以應對單位有一個適當的定義或以適用的標準品/參考品作為對照經計算而得。為得到準確的測定結果,應注意以下幾點:

              必須同時測定供試品和標準品/參考品的劑量反應曲線,而且兩條曲線必須具有平行性。

              應儘可能使供試品隨機分佈及保證測試系統的平衡性。需對引起系統偏差的某些因素進行分析排除,如不同的試驗平板、平板的不同位置(如邊緣效應)、檢測次序、動物實驗中的籠子效應等。

              以相對效價測定方法為例,準確度驗證的範圍應包括方法日常使用的範圍;可信賴的準確度評估需要測定範圍內至少3個效價水平,推薦5個效價水平的評估;最常用的方式是通過稀釋標準物質或已知效價的樣品獲取目標標效,這種類型的方法經常被稱為稀釋線性試驗。

              3
              精密度

              由於各種生物活性測定方法的變異均較大,所以精密度往往不太理想。

              重複性的驗證,建議在期望的濃度範圍內至少選取三個濃度水平,每個濃度至少應測定5次,求得每個濃度水平的精密度。

              一個實驗室所有常規試驗進行時總的變異決定了中間精密度的必要性,建議使用交叉或嵌套的實驗結構會揭示程序變異的重要來源,保證長期條件下變異具有代表性。建議在期望的濃度範圍內至少選取三個濃度水平,每個濃度至少應測定3次,求得每個濃度水平的精密度。

              對於不同測定方法,其精密度可有較大不同,一般情況下,酶法:小於20%;結合試驗:小於20%;細胞試驗:小於30%;動物試驗:小於50%。對於一些尚不成熟的試驗方法或某些特殊方法(如噬斑試驗),其方法變異可能會更大些。

              4
              線性

              線性關係一般是指檢測結果與樣品含量的直線相關性,而且一般情況下線性關係是定量測定的基礎,所以應儘可能摸索出存在較好線性關係的測定方法並進行線性驗證。

              線性可以直接對標準品、供試品進行測定。為了建立線性關係,建議至少要用5個濃度點,每一濃度測定3次,每次重複測定3份,用這些結果計算響應值與被分析物的濃度的比例關係,或通過定義明確的數學計算形成比例關係。

              某些生物活性測定方法線性範圍較小(如細胞測定中呈 S 曲線),採用曲線擬合的方法應更合理。

              應提供相關係數、Y 軸上的截距、回歸線的斜率等數據,還可以分析實測值與回歸線的偏差(離散性),以助於對線性作出評價。

              5
              範圍

              具體的範圍一般根據檢測的目的而設定。驗證時所設定的範圍應至少包括了產品規範中的範圍,如標準中規定成品生物活性應為標示量的80%~120%,則驗證的範圍可設定為標示量的70~130%。

              對於生物製品的生物活性測定而言,精密度、線性和範圍是非常重要的驗證參數。為減少驗證工作的繁雜性,可將範圍研究與精密度、線性研究合併進行。

              6
              耐用性

              由於生物學測定結果對分析條件往往比較敏感,所以方法的耐用性驗證非常重要,根據具體情況,可針對關鍵的參數進行耐用性驗證。

              耐用性是通過有效地改變實驗方法的參數,來測定此改變對試驗結果的影響,即實驗結果不受影響的承受程度。在每種試驗條件下,對準確性、精密性、或其他參數進行測定,以確定試驗方法的耐受或承受能力。在研製階段即應進行耐用性的評估,它應能表明在方法的參數有微小改變時該分析方法仍然是可靠的。

              7
              檢測限度和定量限度

              對於已建立的雜質檢測方法,應進行檢測限和定量限驗證。檢測限和定量限可以通過直觀法、信噪比法等測定。

              1) 案例分析

              以下相對效價測定方法應驗證僅供參考。

              9-1  相對效價測定方法驗證案例

              驗證項目

              驗證內容

              專屬性

              基質成分、溶劑單獨和混合狀態下對效價測定無干擾;

              準確度

              測試範圍內製備5個濃度水平樣品,每個濃度重複測定3次;

              線性範圍

              測試範圍內配製6-8個濃度樣品,每個濃度重複測定3次,每次重複測定3份;

              重複性

              配製測試範圍內高中低3個濃度樣品,,每個稀釋度測定10次

              中間精密度

              考察不同測試日期,不同分析者和不同試劑批號間方法精密度,配製測試範圍內高中低3個濃度樣品,每個濃度測試3次;


              內容持續更新中,敬請關注

              近期培訓


              製藥企業風險管理高級研修班 台湾--4月13日-14日 成都--4月25日-26日

              年度培訓


              2018年度驗證系列課程安排



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