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              技術重複 vs 生物學重複

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              樓主 2020-02-23 13:40:29
              舉報 只看此人 收藏本貼 樓主

              編者按:生物醫學研究常常涉及重複實驗以及統計分析,不少菜鳥(剛入門的研究生)對其中的重複實驗應該怎麼設計感到困惑。為此,B.J童鞋特意把2012年EMBO Reports的一篇關於這個主題的文章翻譯成中文,以饗讀者。中文版本略有刪節和修改,感興趣的讀者也可以直接閱讀原文。如有謬誤,還盼同行指正!


              Replicates and repeats—what is the difference and is it significant?

              A brief discussion of statistics and experimental design

              David L. Vaux, Fiona Fidler & Geoff Cumming


              技術重複與生物學重複

              翻譯:B.J

              校閱:Lee


              科學是從反覆的實驗和觀察中獲得的知識。為了使人信服,一篇科學論文需要提供結果可重複的證據。這種證據可能來自於多次獨立重複整個實驗,或者不同技術獨立實驗得到的數據,並使用恰當的統計學方法——置信區間(CI)或顯著性檢驗(P)。在過去的幾年裡,很多雜誌都對作者以及編輯強化了他們的指導方針,以此來確保誤差線在圖例中被描述出來(如果誤差線在圖中出現的話)並且對圖像處理軟體的使用建立標準。這些措施對提高圖像質量以及減少沒有描述誤差線的論文數量起到了幫助。然而,問題還存在於重複實驗以及獨立重複數據如何被描述和解釋。因為生物實驗對象的複雜性,通常用重複測量(一般稱為「技術重複」)來監測實驗效果,但這樣的重複不是獨立假設檢驗,因此不能為主要結果的再現性提供證據。在這篇文章里,我們將舉例解釋為什麼從「技術重複」中得到的數據不能被用來對假設的正確性做出推論,不能被用來計算Cl以及P值,也不應該出現在圖中

               

              一、例子1——(BDL蛋白對於骨髓細胞響應細胞因子HH-CSF的作用)

              1. 錯誤的實驗設計與無效的數據處理

              我們正在檢驗一個假設:Bdl基因編碼的BDL蛋白對於骨髓細胞響應細胞因子HH-CSF是必須的。我們有野生型和純合的Bdl基因缺失小鼠,還有一小瓶重組的HH-CSF。我們準備了來自單隻WT和Bdl-/-小鼠(Bdl+/-雜合子交配得到的同窩同性別仔鼠)的骨髓細胞懸浮液並用血球計數了懸浮細胞的數量,隨後將他們調整到每毫升軟瓊脂糖生長培養基溶劑中有1×105個細胞。我們加入1毫升懸浮液的等分試樣到10個35×10mm培養皿中,每個包含10微升鹽水或純化的重組小鼠HH-CSF。

              我們在培養箱中放入四組(每組十個)軟瓊脂培養物:第一組十個平板有WT骨髓細胞與生理鹽水;第二組有Bdl-/-細胞與生理鹽水;第三組具有WT細胞和HH-CSF;第四組具有Bdl-/-細胞和HH-CSF。一周后,我們從培養箱中取出平板,並用解剖顯微鏡計數每個平板上的細胞克隆數(>50個細胞的集落)。表1列出了計數的克隆數。

              我們將計數結果繪製在一張圖上。如果我們僅僅繪製每組一個平板的克隆數(圖1A顯示了平板1的數據),很明顯HH-CSF對於很多克隆的產生是必需的,但是Bd1-/-細胞的反應是否與WT細胞的反應有顯著差異,並不是很明顯。此外,圖看起來不夠「科學」;在這裡沒有誤差線和P值。另外,我們只展示了一個平板的數據,這就違背了科學最基本的規則,那就是相關數據應該被記錄並且經過分析,除非能夠給出好的理由來說明為什麼一些數據被省略了。

              為了使圖看起來更好,我們可以在圖中增加每組前三個平板的克隆平均數(圖1B),並附帶誤差線來報告每種類型三個數值的標準誤差(SE)。現在,它看起來更加像知名度高的雜誌中的圖了。但是當我們用每種類型的三個平板的數據來評估WT和Bdl-/-細胞對HH-CSF反應的統計學差異顯著性時,我們發現P>0.05,這表明他們的差異不顯著。因為每組我們還有七個平板,所以我們可以繪製全部10個平板的平均值和SE,並重新計算P值(圖1C)。現在,我們很高興發現了WT和Bdl-/-之間有非常顯著的差異性,P<0.0001。

              然而,雖然在統計學上他們的差異非常顯著,但是列的高度並沒有顯著差異,很難看出誤差線。為了補救這一點,我們只需要將y軸的起點由0改為40(圖1D),這樣就能強調對HH-CSF相應的差異性。儘管這樣做需要去除生理鹽水對照的因素,但對高端雜誌來說這並沒有視覺印象那樣重要。

              通過小小的努力,無需另外的實驗,我們就將一個平淡無奇的結果(圖1A,B)轉變成了一個有顯著差異P值,為我們的假設(BDL對HH-CSF的響應是必須的)提供強有力支持的,看起來屬於高端雜誌的一張圖(圖1D)。


              2. 問題在哪?

              首先,我們的數據並沒有證實BDL對於骨髓細胞響應HH-CSF是必須的這一假設,事實上是反駁了這一假設。很明顯,在沒有BDL時,骨髓細胞克隆仍然在生長,儘管數量沒有Bdl基因完整時那樣大。實驗結果與「required」、「essential」、「obligatory」之間並沒有什麼聯繫,但在看到局部效應時仍然經常會被不恰當的使用。至少我們應該將假設進行修正,或許可以改為「BDL對骨髓集落形成細胞完整響應HH-CSF是需要的」。

              第二個主要的問題是P值的計算以及統計顯著性是建立在「技術重複」組的SE上,但是每個條件下的10個重複組都是由一個小鼠的單一骨髓懸浮液得到的。在這樣的情況下,我們最多只能推斷出從特定WT小鼠與從基因刪除小鼠獲得的骨髓懸浮液中克隆形成細胞的濃度之間的統計學顯著差異性。我們只做了一個對照,所以n=1,不管我們計數了多少個重複的平板。為了能夠得到一個對所有WT小鼠和Bdl-/-小鼠都普遍適用的推論,我們需要多次重複我們的實驗,每種類型的小鼠需要用數只來做幾組獨立對照。

              從重複的平板中得到的結果是相互串聯的而不是獨立的數據,因為他們都來自於相同的骨髓細胞懸浮液。例如,如果我們在確定骨髓細胞懸浮液的濃度時犯了錯誤,這種錯誤會系統性的適用於所有平板。在這種情況下,我們用血球計來數出骨髓細胞最初的數量,這種方法只能給出±10%的精確度。因此,無論我們數了多少個平板,或者在圖1中的誤差線有多小,做出結論說在WT和Bdl-/-中存在差異都是無效的。另外,即使我們用流式細胞分析儀來精確地將相同數量的骨髓細胞分揀到每個平板中,我們還是只檢測了單隻Bdl-/-小鼠的細胞,所以n還是等於1。

              為了具有說服力,介紹新發現的科學論文需要提供結果具有重複性的證據。雖然會有人認為即使n=1,提出的假設也可能代表了一項重要的科學發現。但是,如果有人聲稱他有一隻會說話的狗並且在一個場合下已經觀察到這隻狗說了一個字的話,很少有人會相信,大多數人會要求這隻狗多說幾個字並且在幾個場合下有一些獨立的目擊者見證。克隆羊多利代表了一項科學突破,但是它只是Campbell等人描述下的五隻中的一隻,此外還有8個胚胎用微衛星分析鑒定顯示和核供體細胞完全相同。


              3. 正確的實驗設計與有效的數據處理

                      統計只能對獨立樣本所在的總體進行推論在最初的實驗中我們將骨髓細胞懸浮液等分得到重複組(圖2A),因此我們只能將結論推廣到等分樣本來源的總體——在這種情況下,總體就是單個小鼠的骨髓細胞懸浮液。為了檢驗我們的假設,有必要再做一個圖2B中顯示的那樣的實驗——骨髓分別從隨機的WT小鼠樣本和Bdl-/-小鼠樣本中分離得到。只有這樣,我們才能與WT小鼠的情況進行比較,得到關於Bdl-/-小鼠的結論。而在圖2A中,無論我們計數了多少個重複的平板,與WT小鼠(是與我們假設相關的對照)進行過對比的Bdl-/-小鼠的數量是1,所以n=1。與之相反,在圖2B中,我們將三隻Bdl-/-小鼠與三隻對照組小鼠進行了對比,所以n=3,不管我們處理了每隻小鼠骨髓細胞三個重複平板還是三十個重複平板。在這裡要注意的是,出於統計學的原因,樣本數量n要大於3是非常合理的

                      此外,通常還建議用一些其它的方法來檢驗我們的假設,例如,用抗體來抑制HH-CSF或者Bdl,或者在Bdl-/-細胞中重新表達Bdl基因的cDNA。

               

              二、例子2qRT-PCR

              確定mRNA丰度最普遍的方法是實時定量逆轉錄PCR(qRT-PCR;下面的例子也同樣非常適用於ELISA或者相似的實驗)。這個實驗通常使用多孔板,以便PCR儀能夠同時檢測多個樣本。我們要用qRT-PCR去比較對照組骨髓細胞與HH-CSF處理組骨髓細胞中Bjm基因的mRNA表達水平,以此來檢驗HH-CSF誘導Bjm基因表達的假設。我們從一隻正常小鼠中分離出骨髓細胞,並將含有1百萬個細胞的等分試樣分配到六孔板中的兩個孔中(目前我們只用了六孔板的兩個孔)。我們在一個孔中(對照)加入4ml普通的培養基,在另一個孔中(實驗)加入添加HH-CSF的混合培養基。平板孵育24h后將細胞轉移到兩個tube管中用TRizol來提取RNA。然後將RNA懸浮在50uLTRIS做緩衝的無RNA酶的水中。

              我們從每個管中取出10uL分別加入到兩個新的管中,這樣每個試樣中Actin(對照)和Bjm的信息都能得到確認。現在我們有了四管,每管有10uLmRNA溶液。我們製作了兩套反應混合物,這兩套混合物唯一的不同就是一個有ActinPCR引物,一個有Bjm引物。我們在四個管中每管添加40uL的反應混合物,這樣每管都是50uL。混合之後,我們從四管樣品中分別得到3個10uL的等分試樣,接著將它們放到384孔板中的三個孔里,這樣一共有12個孔含有RT-PCR混合物。然後將平板放到熱循環儀里。一個小時后,得到結果的電子數據表。

              接著我們計算了三組從HH-CSF處理過的細胞中得到的RNA的Bjm信號與Actin信號的比率,還要三組對照組的Bjm與Actin的比率。在這個實驗中,三個重複組的變化不會被抽樣誤差所影響(這是造成早期骨髓集落形成檢測中大多數集落數變異的主要原因),但是這隻能反映重複組的保真度,也可能是PCR儀中不同的孔在加熱中的一些變化。3個10uL的等分試樣都來自相同的,單獨的mRNA準備品,所以我們對這個管中的內容做出推論。想之前的那個例子一樣,在這個實驗中,我們的n還是等於1,不能對主要的實驗假設做出推論。就算在每個RNA樣品在10個或者100個孔中測定,結果還是一樣的;我們只是在比較一個對照樣本和一個實驗樣本,所以n=1(圖3A)。為了得到關於HH-CSF對Bjm表達影響的一般結論,我們必須要用幾組獨立的樣本進行試驗,這些樣本來源於單獨培養的經HH-CSF刺激的骨髓細胞(圖3B)。

              例如,我們可以在組織培養板的六個孔中都放上骨髓細胞,然後用HH-CSF來單獨培養其中的三個,其餘的三個用不添加HH-CSF的培養基來單獨培養作為對照。從這六個培養物中我們可以得到mRNA,然後把每個樣品分到6個孔中,用qRT-PCR測定Actin和Bjm的RNA水平。在這個實驗中,機器要閱讀36個孔。如果實驗照這種方法來做,那麼n=3,因為這裡有三個獨立的對照培養還有三個獨立的依賴HH-CSF的培養,這就是在檢驗我們關於HH-CSF誘導Bjm表達的假設。接著我們就可以概括關於重組HH-CSF小瓶對Bjm表達的影響的結論。然而,在這個實驗中(圖3B)P>0.05,所以我們不能排除出現的差異只是偶然,HH-CSF對Bjm的表達沒有影響這種可能性。要注意的是我們也不能總結說它是沒有影響的;如果P>0.05,我們能夠做出的唯一結論就是我們不能做出任何結論。要是在圖3A中我們計算並展示了重複組的誤差和P值,那麼我們已經錯誤得進行了總結,並且可能誤導了讀者做出「在統計學上HH-CSF在刺激Bjm轉錄中有很重要的作用」這樣的結論。

               

              三、為什麼還要費心設置技術重複?

              我們已經知道「技術重複」不允許用於推斷或做出與我們檢驗假設相關的結論。那麼,技術重複可以全部省掉嗎?答案是:不應該!技術重複是對實驗的內部質量檢查

              例如,在表1和圖1所描述的實驗中如果一個用生理鹽水處理的骨髓細胞的平板有100個集落,那麼你會立馬猜測有什麼地方出錯了。你可以檢查平板來看看是不是弄錯了標記。你可以用顯微鏡來觀察集落,然後會發現實際上他們被酵母菌菌落污染了。要是你沒有做任何的重複組,很有可能你根本不會意識到錯誤已經發生了。

              圖4展示的是和圖3一樣的qRT-PCR的實驗結果,但是在這個實驗中,有一組的三個PCR比率的變化比其他的都大。此外,這種大的變化可以由三個重複組中的一個值來解釋—也就是圖中最上面的圓圈。如果你得到了像圖4A中的結果,你要看看重複組裡ActinBjm單獨的PCR數據哪個比較奇怪。如果Bjm引物PCR樣本異常高的話,你可以檢查下PCR板中相應的孔,來看看它和其他的孔的體積是不是一樣。與之相反,如果Actin PCR的值遠小於其他兩個重複,檢查下平板上的孔你可能會發現體積特別小。出現異常的結果要麼就是意外地加了兩份等分試樣,要麼就是加了兩份的PCR引物反應混合液。或者可能是移液管的頭鬆了,或者有晶體模糊了光學,或者移液管被一些雜物堵到了等等等等。

              因此,重複組會提醒你有異常結果出現,這樣你就會知道什麼時候能繼續往前,什麼時候要重複試驗。重複組是對做出的實驗保真度的內部檢查。他們可以提醒你管道、泄漏、光學、污染、懸浮、混合或混亂的問題,但是他們不能被用來推斷結論。

              因為技術重複與被檢驗的假設不相關,他們本身以及從他們得到的統計不應該出現在圖中。在圖4B中,大的點表示的是圖4A里排除了異常重複組數據后,重複組的平均值。儘管在這張圖中你可以繪製出三個獨立的培養基處理和HH-CSF處理的mRNA結果的平均值和標準誤差(SE),但在這種情況下,我們繪製了獨立的結果出來並且沒有顯示出誤差線。當獨立數據點的值比較低時,他們被畫在圖上時是比較容易被看到的,我們建議只需要這樣做就行了,不用顯示出平均值和誤差線。

               

              四、我們在讀文章的時候需要找什麼?

              儘管「技術重複」是一個非常有價值的監測實驗性能的內部控制,但是沒有必要將其顯示在發表文章的圖裡面,因為從技術重複中得到的統計數值與我們檢驗假設不相關。如果技術重複的統計數值、誤差線、P值顯示出來了,會誤導讀者認為這些與文章結論相關。如果你正在閱讀一篇論文,並且看到一個圖裡的誤差線(無論是SD,SE還是CI)都非常小,可能會提醒你它們來自重複樣本而不是獨立樣本。你應該仔細看圖例來確定統計數據是來自於重複樣本還是獨立樣本。如果圖例沒有聲明誤差線是什麼,n是什麼,結果是重複樣本還是獨立樣本,問問你自己這些刪減是不是破壞了論文,還是讀了論文之後一些知識還是能得到。

              如果圖中的數據來自於技術重複的統計結果,那麼你要持懷疑態度,因為在這種情況下,n=1,並不能得出有效結論,即使作者說這是「代表性」結果——如果作者有更多的數據,應該被包含在發表的結果中。如果你想看更多什麼不能做的例子,在網上搜索關鍵詞「SD of one representative」, 「SEM of one representative」, 「SD of replicates」或者「SEM of replicates」。

               

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